dyrkning af mikroorganismer

Der bruges flydende og faste vækstmedier. For de sygdomsfremkaldende (patogene) bakterier indgår der ofte kødafkog (bouillon) i mediet, og dyrkningstemperaturen er som regel menneskets kropstemperatur, ca. 37 °C.

Faste medier laves ved tilsætning af agar til vækstmediet. De nødvendige næringsstoffer blandes i den opvarmede flydende agar. Blandingen hældes op i petriskåle. Ved afkøling stivner agaren og der dannes en jævn overflade, som prøven kan sås ud på.

Til klinisk mikrobiologisk diagnostik af bakterier i patientprøver, anvendes batchkultur, dvs. at næringsmediet tilsås og bakterierne vokser indtil vækstsubstratets bestanddele er opbrugt, hvorefter væksten går i stå, som illustreret i figur 15. Det sker for de fleste bakterier i løbet af ½-1 døgn, bortset fra de langsomt voksende tuberkulosebakterier, så bakterierne udsås den ene dag og resultatet aflæses næste dag.

Til forskningsformål anvendes sommetider kontinuerlige dyrkningsbetingelser (continuos culture), hvor der hele tiden tilføres nyt vækstmedium og en lignende mængde samtidig fjernes, så bakteriedelingerne fortsætter i så lang tid, forsøget kræver, måske en eller flere ugers tid (figur 4).

De fleste sygdomsfremkaldende bakterier vil vokse på medierne i løbet af et eller få døgn, hastigheden er vist på billedet af vækstkurven af en bakterieart i flydende medium (figur 15). En undtagelse er tuberkulosebakterien, der kræver specialmedier og lang dyrkningstid for at vokse. Der kan gå flere uger før bakteriekolonier af tuberkulosebakterien dukker op.

Dyreforsøg kan være nødvendige i enkelte tilfælde og har givet afgørende viden om mekanismen ved forskellige infektionssygdomme og ved afprøvning af lægemidler. Som forsøgsdyr bruges sædvanligvis mus, marsvin og kaniner men også minigrise, hvis fysiologi og anatomi mere ligner menneskers.

Bakterier sprøjtes ind i et dyr for at undersøge deres evner til at fremkalde infektion. Det kan desuden gøres, hvis en ny sygdom opstår, hvor det ikke er muligt at finde ud af, hvilken mikroorganisme, der er årsagen, fordi der ikke vokser kolonier frem på de almindelige substrater. Det skete fx, da man diagnosticerede de første tilfælde af legionærsygdom.

Bakterierne udsås med såkaldt trinvis spredning, hvilket er en fortynding af prøven, så enkeltliggende kolonier opnås oven på substratoverfladen i petriskålen (figur 1). Efter inkubering vokser bakterierne op i kolonier, der minder om små flade eller hvælvede klatter på 1-5 mm (figur 5). Disse kolonier kan have et karakteristisk udseende.

I nogle tilfælde dannes pigment, som også er med til at karakterisere bakterien. Det samme gælder svampekolonier (figur 6 og 7). Hvis der i patientprøven er flere forskellige bakterier (figur 5), fx fra normalfloraen, foruden den sygdomsfremkaldende bakterie eller svamp, kan enkeltliggende kolonier igen udsås på et nyt substrat til nærmere identifikation.

Ofte kan kulturen have en typisk lugt. Væksthastigheden og koloniernes størrelse og form kan være forskellig. Nogle gange er kolonierne slimede og flyder sammen, andre gange er de tørre og rynkede. Ofte bruges der en tilsætning af 5-10 procent blod til agaren.

Enkelte bakterier danner et toksin (hæmolysin), som opløser de røde blodlegemer, og da ses en lys ring (halo) eller opklaring rundt om bakteriekolonierne, hvilket kaldes beta-hæmolyse. Et eksempel på dette er hæmolytiske streptokokker (figur 1).

Sommetider er det ikke så enkelt at bestemme hvilke bakterier, der vokser i hver koloni. I disse tilfælde er det nødvendigt at udså igen fra enkelte kolonier på hvert sit substrat. Derved fås en renkultur af bakterien, der kan undersøges videre. Den videre undersøgelse omfatter fx bakteriens vækstkrav, og hvilken slags enzymer den laver, hvilket gøres ved at se på dens evne til at spalte proteiner og sukkerarter, og de stofskifteprodukter, der derved produceres (figur 13).

På de klinisk mikrobiologiske afdelinger anvendes nu massespektrometri til at karakterisere de isolerede bakteriers proteinsammensætning (metoden hedder MALDI-TOF = matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight, figur 19), som udføres på materiale fra en enkelt koloni og er meget hurtig og præcis. Metoden giver dog ikke informationer om bakteriens egenskaber. Yderligere undersøges bakteriens følsomhed over for forskellige antibiotika (figur 15), som kan være karakteristisk for nogle bakteriearter.

Det første formål er at undersøge om patienten har eller har haft en infektion med en given mikroorganisme. Den sygdomsfremkaldende mikroorganisme fremkalder et antistofsvar hos patienterne i løbet af ca. 1-3 uger (figur 8). Ved at måle disse antistoffer i patientens blod, kan man sommetider få hjælp til at diagnosticere patientens sygdom, hvilket er vigtigt, hvis det ikke lykkes at påvise mikroorganismen ved dyrkning, mikroskopi eller PCR. Ved sådanne serologiske tests er det serum fra patientens blod, der undersøges.

Det andet formål med serologiske tests er at bestemme den mikroorganisme, som man har fremdyrket fra patientprøven. Ved vaccination af kaniner med bakterier er det muligt at fremkalde specifikke antistoffer, der kan bruges til at identificere arten og typen (serotypen) af de pågældende fremdyrkede bakterier. Sådanne antistoffer produceres af firmaer, hvor man kan købe dem til laboratoriediagnostik. De benævnes serologiske tests (figur 3).

Hvis man fx har mistanke om, at det drejer sig om en bakterie i Salmonella typhus-/paratyphus-gruppen, kan man prøve, om den aktuelle bakterie reagerer med sådanne antistoffer. Det kaldes typebestemmelse af de fremdyrkede bakterier. Her er det kaninserum fra vaccinerede kaniner, der anvendes til at undersøge mikroorganismen fra patienten.

Det tredje formål med serologiske tests er at påvise antigener, fx polysakkarider, lipopolysakkarider eller proteiner, fra den inficerende mikroorganisme, der udskilles i urinen under lungebetændelse (Streptococcus pneumoniae og Legionella pneumophila) eller som findes på bakterierne i svælgsekret under halsbetændelse.

Der kan påvises et antigen (gruppe A-antigenet) i sekretet fra Streptococcus pyogenes gruppe A på fem minutter ved en serologisk test. På den måde kan testen udføres mens patienten venter hos lægen, så penicillinbehandlingen straks kan startes.

Ved influenza A-infektion kan man på lignende måde påvise influenza nukleoprotein i næse- og svælgsekret på 15 minutter, så behandling og isolation straks kan startes. Ved disse eksempler er det også kaninserum fra vaccinerede kaniner, der anvendes til at påvise mikroorganismen i patientens sekret eller urin.

Behovet for hurtigdiagnostik med direkte påvisning af bakterier og svampe i klinisk prøvemateriale er vigtigt. Den klassiske metode, som udføres i alle laboratorier, er mikroskopi af gramfarvede præparater enten direkte på prøvematerialet fra patienten (figur 11, 12, 17, 18), eller af fremvoksede bakterier eller svampe i fx en bloddyrkning.

Bakterieelementer, der egner sig til andre måder for direkte påvisning, er proteiner, polysakkarider og lipopolysakkarider. De er alle antigener, så de kan påvises med antistoffer, hvis de fx udskilles i urinen eller findes i spyt og svælgsekret. Derudover nukleinsyrer (DNA eller RNA), som påvises med PCR reaktion. De enkelte virus kan ikke ses i prøvematerialet med almindeligt lysmikroskopi, men kræver elektronmikroskopi (figur 9) med meget højere forstørrelse, fordi de er så små.

Når man har velegnede antigener og antistoffer, kan protein- og polysakkaridpåvisning udføres med immunologiske metoder. De polysakkarider, der hyppigst undersøges for, er fra cellevæggen i Streptococcus pyogenes gruppe A (figur 1) og kapslen på pneumokokker og på gærsvampen Cryptococcus neoformans. Bakteriespecifikke, svampespecifikke og virusspecifikke nukleinsyrer kan påvises ved brug af polymerasekædereaktion (PCR) (figur 10).